Grazie per aver visitato nature.com.Stai utilizzando una versione del browser con supporto limitato per i CSS.Per ottenere la migliore esperienza, ti consigliamo di utilizzare un browser più aggiornato (o disattivare la modalità di compatibilità in Internet Explorer).Nel frattempo, per garantire un supporto continuo, stiamo visualizzando il sito senza stili e JavaScript.Carosello con tre diapositive mostrate alla volta.Usa i pulsanti Precedente e Successivo per navigare tra tre diapositive alla volta o i pulsanti con i puntini alla fine per saltare tre diapositive alla volta.Rainer Kurmayer, Elisabeth Entfellner, … Li DengHeon Woo Lee, Bum Soo Park, … Myung-Soo HanJérémy Surre, Claude Saint-Ruf, … Ivan MaticHaim Treves, Beata Siemiatkowska, … Mark StittJohan Decelle, Ehsan Kayal, … Laure GuillouJana Pilátová, Tomáš Pánek, … Peter MojzešJoachim Pfister, Alexander Lichius, … Clemens DecristoforoBrittany M. Schieler, Megha V. Soni, … Kay D. BidleTakanori Maeno, Takanori Uzawa, … Yoichiroh HosokawaScientific Reports volume 12, Articolo numero: 15297 (2022 ) Cita questo articoloL'applicazione di saggi di vitalità cellulare stabiliti come il metodo di colorazione tripan blu comunemente usato alle cellule di corallo non è semplice a causa dei diversi parametri di coltura e delle diverse caratteristiche cellulari specifiche delle cellule dei mammiferi rispetto agli invertebrati marini.Usando Pocillopora damicornis come modello, abbiamo caratterizzato l'autofluorescenza e testato diverse combinazioni di coppie di coloranti fluorescenti per identificare indicatori di vitalità alternativi.La citotossicità di diverse molecole rappresentative, vale a dire piccole molecole organiche, proteine ​​e nanoparticelle (NP), è stata misurata dopo 24 ore di esposizione utilizzando la coppia di coloranti fluorescenti Hoechst 33342 e SYTOX orange.I nostri risultati mostrano che questa coppia di coloranti può essere distintamente misurata in presenza di proteine ​​fluorescenti più clorofilla.Cellule di P. damicornis esposte per 24 ore a NP Triton-X100, insulina o biossido di titanio (TiO2), rispettivamente, a concentrazioni comprese tra 0,5 e 100 µg/mL, hanno rivelato una LC50 di 0,46 µg/mL per Triton-X100, 6,21 µg /mL per TiO2 NP e 33,9 µg/mL per insulina.Questo lavoro presenta l'approccio utilizzato per personalizzare le coppie di coloranti per i saggi di vitalità cellulare basati sull'integrità della membrana considerando l'autofluorescenza specifica per specie e genotipo dei coralli scleractiniani, vale a dire: caratterizzazione della fluorescenza endogena seguita dalla selezione di coloranti che non si sovrappongono ai segnali endogeni.La citotossicità, il potenziale di causare la morte cellulare, viene misurata tramite diversi endpoint1.Questi endpoint possono includere l'integrità della membrana, la funzione mitocondriale, la proliferazione e l'apoptosi rispetto alla necrosi.È importante combinare sistematicamente più endpoint, come l'integrità della membrana e il meccanismo di morte cellulare, per ottenere informazioni sui potenziali percorsi coinvolti nella tossicità cellulare.Il modo più comune per misurare questi endpoint consiste nell'utilizzare saggi colorimetrici o fluorometrici che comportano l'aggiunta di un colorante indicatore.Sono stati sviluppati molti coloranti indicatori per diversi endpoint e trovare il giusto tipo di colorante dipende dal sistema modello cellulare studiato, dalla produttività desiderata, dagli strumenti disponibili per l'analisi e dal costo dei reagenti2.I coloranti indicatori fluorescenti (fluorofori) sono più comunemente usati nei saggi biochimici e cellulari nella coltura cellulare dei vertebrati poiché la fluorescenza è più sensibile3 e la fluorescenza è utilizzata in molti strumenti (microscopia, spettroscopia, citometria a flusso).I fluorofori utilizzati per valutare la citotossicità emettono principalmente luce visibile nelle bande di colore blu, verde e rosso.La tabella 1 include i fluorofori comuni utilizzati per valutare l'integrità della membrana e distinguere tra cellule vive e morte durante l'esecuzione di test di vitalità.La necessità di comprendere su scala cellulare meccanismi come la simbiosi, la calcificazione, la guarigione delle ferite e lo sbiancamento è in aumento poiché i coralli costruttori di barriere coralline (Scleractinia) sono più che mai sotto stress a causa dell'aumento delle temperature della superficie marina, dell'acidificazione degli oceani, delle malattie, dell'inquinamento e della perdita di habitat4 .Mentre molti studi si sono concentrati sulle dinamiche su scala di colonia o su scala di polipo, gli studi cellulari sono meno comuni perché la comunità scientifica ha riferito di aver generato colture di cellule di corallo scleractiniano axeniche e immortali solo due volte dall'inizio degli anni '90 (vedi 5,6) e permangono preoccupazioni riguardo alla contaminazione e l'identificazione delle cellule man mano che la nostra conoscenza dell'olobionte di corallo cresce4,7.L'ulteriore sviluppo delle colture di cellule di corallo scleractiniano richiede una valutazione quantitativa della sopravvivenza attraverso la conta di base delle cellule vive e morte.La sopravvivenza è fondamentale per determinare il successo del metodo di coltura, è importante avere un approccio chiaro per quantificare la vitalità della popolazione.L'uso del tripan blu, un colorante colorimetrico cellulare impermeabile, per quantificare la morte cellulare è il metodo più riportato in relazione alle colture di cellule di corallo nonostante i suoi limiti.Il problema principale del trypan blue è la sua capacità di legarsi alle proteine ​​nella sospensione cellulare, non solo a quelle rilasciate dalle cellule morte.Ciò si traduce in aggregati blu che ostacolano il conteggio delle cellule.Esistono prove che il blu tripan può essere tossico in caso di tempi di incubazione più lunghi8.Altri coloranti colorimetrici che sono stati testati su cellule di corallo includono coloranti cellulari impermeabili come il blu di Evans e il nero amido, nonché coloranti vitali come il rosso neutro e il blu di toluidina9,10.Tuttavia, la gamma di tecniche di imaging e misurazione per le colorazioni colorimetriche è limitata rispetto alle colorazioni fluorescenti9.Il lavoro sulle alghe simbiotiche ha mostrato che la colorazione dell'acido nucleico SYTOX Green (λex 504 nm, λem 523 nm) e lo ioduro di propidio hanno etichettato con successo i nuclei delle cellule morte di Symbiodinium clade A e B9 e Symbiodinium sp.cellule isolate da Stylophora pistillata11,12.Tuttavia, le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di STYOX Green si sovrappongono alla proteina fluorescente verde che è presente in molte specie ospiti di coralli e in alcune specie di alghe simbiotiche (ad es. Breviolum minutum, precedentemente Clade B).Le proteine ​​fluorescenti estratte da invertebrati marini, in particolare Cnidari, hanno contribuito a far progredire la ricerca biologica grazie alla loro capacità di fungere da marcatori molecolari e biosensori13.La proteina fluorescente verde (GFP) è stata caratterizzata per la prima volta nella medusa Aurelia victoria (Aequorea victoria)14 ed è ora diventata uno degli strumenti più utili nella scienza e nella medicina moderne15.Finora sono stati identificati più cromofori di corallo, tra cui la proteina fluorescente ciano (λex 404–477 nm, λem 485–495 nm), la proteina fluorescente verde (λex 478–508 nm, λem 500–520 nm) e la proteina fluorescente rossa o la clorofilla simbiotica ( λex 560–589 nm, λem 576–595 nm) e rosa-viola-blu non fluorescente (λex 560–588 nm)16,17,18 (Fig. 1).Proteine ​​fluorescenti gialle (λex 425–550 nm, λem 525–570 nm) e rosso vivo (λex 578 nm, λem 617 nm) sono presenti anche nei coralli, ma sembrano essere specifiche di Agaricia sp.19 e Porites lobata (rosa fenotipo)20.Va notato che, oltre alla clorofilla, altri segnali fluorescenti endogeni dal microbioma corallo (incluse le alghe simbiotiche) non sono stati considerati qui a causa della differenza di scala in cui potrebbero interferire rispetto a quella in cui è stato eseguito il lavoro.L'uso di fluorofori in cellule con proteine ​​fluorescenti endogene, come le cellule di corallo scleractiniano, rappresenta una sfida perché le lunghezze d'onda di emissione dei fluorofori possono sovrapporsi a quella della fluorescenza endogena emessa da proteine ​​fluorescenti o cellule di alghe simbiotiche (clorofilla) ospitate all'interno delle cellule di corallo, confondendo così il segnale.101 Cromofori di corallo.Selezione di 101 lunghezze d'onda di eccitazione (λex) ed emissione (λem) dei cromofori di corallo riportate in 10 diverse famiglie di coralli (43 specie di corallo scleractiniano) e misurate in Pocillopora damicornis (questo studio).Le specie coralline sono elencate con chiave numerica corrispondente al grafico e [lunghezza d'onda di emissione] rilevate (e riportate in letteratura).I riferimenti sono i seguenti: (1–3, 8–9, 11, 17, 20, 35–36, 38)49;(4)50;(5, 7, 10, 19, 55–57, 61)51;(6)52;(12)53;(13)19;(14-15, 58-59)54;(16, 60)55;(18, 37)56;(21–33, 44–54, 62–97, 99–101)57;(39)58;(34, 41)17;(40)18;(42)59;(43)60, (98)20.L'obiettivo di questo studio era quello di adattare un test di esclusione del colorante basato sulla fluorescenza per le valutazioni di vitalità cellulare e citotossicità alla ricerca sui coralli scleractiniani prendendo in considerazione il segnale fluorescente endogeno (cioè, macchie fluorescenti per differenziare le cellule morte dalle cellule vive che sono rilevabili nel presenza di fluorescenza cellulare endogena).A tal fine abbiamo testato test di integrità della membrana stabiliti sviluppati per cellule di vertebrati su cellule dissociate da Pocillopora damicornis (Fig. 2, cellule miste: corallo e alghe simbiotiche) e studiato la sovrapposizione tra fluorofori di analisi e proteine ​​endogene.Abbiamo quindi utilizzato il protocollo risultante per verificare la vitalità cellulare delle cellule coralline dissociate e testare la citotossicità di tre classi rappresentative di molecole, vale a dire la piccola molecola Triton X-100, la proteina insulina e una nanoparticella ingegnerizzata rappresentativa, il biossido di titanio, come proof-of-concept e prima valutazione degli effetti di diversi tipi di molecole sulla fisiologia delle cellule coralline.Fotografia di Pocillopora damicornis in acquario con polipi che mostrano il fenotipo fluorescente verde (a) e cellule dissociate da P. damicornis colorate con kit di imaging di vitalità cellulare ReadyProbes (rosso: ioduro di propidio per cellule morte, blu: NucBlue per tutte le cellule) ripreso sotto laser confocale microscopio a scansione (Zeiss LSM 710, VCU Microscopy Core) [gli altri colori sono i seguenti: giallo per la fluorescenza della clorofilla e verde per la GFP endogena, DIC impostato per il contrasto sulla cella centrale] (b).I tipi di cellule più riconoscibili sono i dinoflagellati simbiotici (cellule arrotondate marrone-oro, colore generato dalla sovrapposizione di giallo e rosso) e i nematociti (cellule oblunghe con struttura interna simile a un pennello da bottiglia).Altri tipi di cellule non possono essere identificati dalle caratteristiche morfologiche.Il tessuto del corallo scleractiniano Pocillopora damicornis (fenotipo verde, Fig. 2) è stato dissociato dallo scheletro usando l'incubazione di acqua di mare priva di calcio e magnesio per 1 ora come descritto nella nostra precedente pubblicazione.La miscela di cellule è stata lavata e risospesa in terreno di coltura completo (CM, vedere la sezione "Dissociazione e coltura delle cellule di corallo" per i dettagli).Le sospensioni cellulari risultanti sono state quindi osservate al microscopio confocale a scansione laser e analizzate utilizzando un fluorimetro per misurare l'autofluorescenza di P. damicornis.La matrice di eccitazione-emissione (EEM, Fig. 3) mostra cinque picchi di emissione che rappresentano triptofano (λex 280 nm, λem 350 nm, A), proteina fluorescente ciano (B), proteina fluorescente verde (C), proteina fluorescente rossa (D) e la clorofilla degli endosimbionti (E).Le scansioni lambda hanno confermato questi segnali fluorescenti (materiali supplementari S1).Matrice di eccitazione-emissione per Pocillopora damicornis dalla spettrofotometria di fluorescenza UV/VIS.Sono presenti cinque picchi di emissione: triptofano (A), proteina fluorescente ciano (B), proteina fluorescente verde (C), proteina fluorescente rossa (D) e clorofilla (E).L'inserto mostra una matrice di fluorescenza ad alta risoluzione sotto eccitazione UV profonda (da 190 a 200 nm), che contiene anche gli stessi cinque picchi di emissione.Si noti che la fluorescenza della clorofilla presenta un'ampia banda di emissione da ~ 700 nm, che è ben documentata61.Le croci bianche rappresentano le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione della coppia di coloranti utilizzata per la valutazione dell'integrità della membrana (SYTOX Orange e Hoechst 33342).I fluorofori testati sulle cellule di P. damicornis erano Hoechst 33258 (blu, tutte le cellule), Hoechst 33342 (blu, tutte le cellule), NucBlue (blu, tutte le cellule), Calcein blue AM (blu, vivo), Calcein AM (verde, vivo), etidio omodimero (rosso, morto), POPO-3 ioduro (arancione, morto), SYTOX Red (rosso, morto), SYTOX Orange (arancione, morto), BOBO-3 ioduro (arancione-rosso, morto) e Ioduro di propidio (rosso, morto).La scelta dei fluorofori da testare è stata guidata dagli spettri di emissione, dal meccanismo di colorazione e dalle capacità di rilevamento disponibili (microscopio confocale a scansione laser e lettore di micropiastre dotato dei seguenti cubi filtro: DAPI, GFP, RFP e Texas Red).Inoltre, per una maggiore precisione, è stata ricercata una coppia di coloranti con uno che indica le cellule morte e l'altro che indica le cellule vive o tutte.Le cellule calicoblastiche, cioè le cellule calcificanti, sono circa 10 volte più piccole delle cellule gastrodermiche simbiotiche e dei nematociti (noti anche come cnidociti, cellule pungenti) Fig. 2. Senza una combinazione di coppie di coloranti per la vitalità, la densità cellulare può essere facilmente sottovalutata e le cellule più piccole possono inavvertitamente ignorato come detriti.Di questi fluorofori, la migliore combinazione era Hoechst 33342 e SYTOX Orange con Hoechst 33342 che colorava tutte le cellule e SYTOX Orange solo le cellule morte, lasciando il canale rosso per il rilevamento dell'endosimbionte e il canale verde per la GFP endogena (Fig. 4, vedi " Live/dead assay” per i dettagli).I risultati della colorazione per tutti i fluorofori testati sono riassunti nella Tabella 1.Immagini al microscopio a scansione laser a fluorescenza confocale a cellule vive di cellule di Pocillopora damicornis (Zeiss LSM 710, VCU Nanomaterial Characterization Core).Le cellule sono state co-colorate con SYTOX Orange (0,2 µM) e Hoechst 33342 (40 µM) per 30 min.Ingrandimento = 63×.Come descritto nella Tabella 1, diverse macchie vive/morte stabilite non sono adatte alle cellule di corallo a causa della sovrapposizione spettrale con segnali endogeni.Quando si utilizzano filtri passa-banda, l'emissione dalle macchie impermeabili cellulari ioduro di propidio e omodimero di etidio non può essere separata dalla fluorescenza della clorofilla endosimbionte per contrassegnare le cellule morte.La colorazione dell'acido nucleico SYTOX Orange (λex 547 nm, λem 570 nm), anch'essa una colorazione cellulare impermeabile, penetra nelle cellule con membrana plasmatica compromessa e ha una lunghezza d'onda di emissione più lontana da quella della clorofilla.La linea di macchie morte SYTOX è disponibile in diversi colori, che potrebbero essere utili in campioni di corallo con spettri di emissione vicino a 570 nm, come riportato per il numero di coralli Acroporidae, Poritidae e Faviidae (Fig. 1).Per testare la citotossicità delle nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2 NP) e dell'insulina, le miscele cellulari raccolte da P. damicornis sono state placcate su piastre da 96 pozzetti rivestite con poli-d-lisina ad una densità di ~ 400.000 cellule per pozzetto con terreno completo .Dopo un periodo di riposo di 1 ora, le cellule sono state esposte a concentrazioni di insulina e TiO2 NP comprese tra 0,5 e 100 µg/mL nel terreno di coltura.Triton X-100 è stato utilizzato come controllo positivo.La sopravvivenza cellulare è stata misurata dopo 4 ore di esposizione utilizzando i test MTS e LDH e dopo 24 ore di esposizione utilizzando la coppia di coloranti Hoechst 33342-SYTOX Orange.Qui sono stati testati due test colorimetrici: i test MTS e LDH.I test MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carbossimetossifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio) e LDH (lattato deidrogenasi) vengono comunemente eseguiti in combinazione.Sebbene affidabili e semplici, i limiti dei test MTS e LDH sono che il siero e altri composti nei terreni di coltura possono introdurre distorsioni o background21,22.Il test MTS non ha prodotto risultati soddisfacenti dopo 1 h a 25 °C, il tempo di incubazione raccomandato per le cellule di mammifero.La reazione prevista è un cambiamento di colore dal tetrazolio MTS giallo quando viene convertito dal metabolismo cellulare al formazano viola/marrone.Nessun cambiamento di colore è stato misurato anche con tempi di incubazione più lunghi di 6, 12, 24 e 48 h a 25 °C.Le misurazioni dell'assorbanza dei test MTS falliti non sono presentate.Il test LDH ha misurato con successo la presenza di lattato deidrogenasi nel mezzo prelevato dalla cellula di P. damicornis esposta.Tuttavia, i risultati erano variabili e il controllo solo dei media non era coerente durante gli esperimenti (materiali supplementari S.2).Le misurazioni basate sulla coppia di coloranti Hoechst 33342—SYTOX Orange hanno mostrato che le NP di TiO2 riducono la vitalità cellulare di P. damicornis a concentrazioni superiori a 10 µg/mL con una concentrazione letale calcolata del 50% (LC50) di 6,21 µg/mL (intervallo di confidenza del 95%, CI dalle 2.39 alle 15.6) dopo 24 h di esposizione.L'insulina ha anche ridotto la vitalità cellulare di P. damicornis (LC50 33,9 µg/mL, intervallo di confidenza 95%, CI da 9,16 a 1736) per concentrazioni comprese tra 10 e 100 µg/mL dopo 24 ore di esposizione (Fig. 5).L'analisi statistica (ANOVA a due vie con blocco e Tukey post-hoc, vedere la sezione "Analisi statistica") ha rivelato differenze significative tra il controllo (0 µg/mL) e le concentrazioni superiori a 1 µg/mL per tutti i trattamenti (materiali supplementari S.2 ).Differenze significative sono state riscontrate anche tra il trattamento di controllo positivo (Triton X-100) e TiO2 e l'insulina, a conferma della sua efficacia come controllo positivo.Nessuna differenza significativa è stata trovata tra i trattamenti con TiO2 e insulina (Fig. 5, Materiali supplementari S.2).Vitalità delle cellule di corallo dopo 24 ore di esposizione a concentrazioni di Triton X-100 (controllo positivo, lisato cellulare), biossido di titanio (TiO2) e insulina tra 0,5 e 100 µg/mL.Le caselle riassumono i dati con mediana (linea in grassetto) e valori anomali (baffi).Le diverse molecole testate hanno prodotto risultati statisticamente significativi tra 1 e 100 µg/mL ma non tra 0 e 0,5 µg/mL (NS).Il controllo utilizzato (Triton X-100) ha dato risultati significativamente diversi rispetto a TiO2 e insulina, confermando il suo ruolo di controllo positivo.Ulteriori analisi statistiche possono essere trovate in Materiali supplementari S.2.I saggi basati su cellule di mammifero sono scarsamente adattati al lavoro in vitro con cellule di corallo sclerattiniano.Ciò è in parte dovuto alla diversità e all'abbondanza di fluorescenza endogena presente nei coralli costruttori di barriere coralline, ma anche a fattori quali la mancanza di attaccamento cellulare, la salinità (~ 35‰) o la natura fortemente ionica (~ 0,7 M) dell'acqua di mare , e altre incognite.In effetti, man mano che cresce la nostra conoscenza della fisiologia e della funzione delle cellule di corallo, crescerà anche la diversità dei saggi specifici del corallo.La valutazione della vitalità delle cellule di corallo è la chiave per lo sviluppo di altri test poiché la vitalità cellulare è uno degli endpoint più diretti della ricerca in vitro.In questo studio abbiamo sviluppato un quadro per gli scienziati dei coralli per adattare i test di integrità della membrana basati sulla fluorescenza al fenotipo delle specie di corallo di loro scelta.Questo metodo prevede innanzitutto la determinazione accurata dei diversi segnali fluorescenti emessi dal genotipo delle specie di corallo e la ricerca di coloranti fluorescenti che non si sovrappongono o che possono essere facilmente deconvoluti.La coppia di coloranti basata sull'integrità della membrana Hoechst 33342-SYTOX Orange, evita i segnali fluorescenti endogeni delle cellule di P. damicornis, consente la determinazione della vitalità cellulare indipendentemente da un campione di riferimento (controllo) e ci ha permesso di testare la tossicità di TiO2 e insulina in vitro applicato a cellule dissociate per il corallo scleractiniano P. damicornis (fenotipo verde) per la prima volta.Sono stati testati anche due test di vitalità comuni nella ricerca sui mammiferi, i test MTS e LDH, che hanno prodotto risultati insoddisfacenti.La vitalità cellulare è stata precedentemente testata utilizzando il test di riduzione del tetrazolio MTT23.Sia MTT che MTS sono coloranti a base di tetrazolio;tuttavia, MTS si basa su un accettore di elettroni intermedio per la riduzione a formazano.Inoltre, l'assorbanza di fondo del terreno di coltura e del solo MTS alla lunghezza d'onda di misurazione di 490 nm è superiore all'assorbanza di fondo per il test MTT24.Le incoerenze nei risultati del dosaggio LDH, d'altra parte, potrebbero essere dovute alla presenza di altre deidrogenasi, come l'opina deidrogenasi che sono funzionalmente analoghe alla lattato deidrogenasi, utilizzate per rigenerare NAD+ in molti invertebrati25.Montipora capitata, un altro corallo scleractiniano, mostrava attività di strombina deidrogenasi e alanopina deidrogenasi ma nessuna attività di LDH25.Un'altra potenziale spiegazione per gli scarsi risultati del test LDH potrebbe essere il ricco contenuto proteico del mezzo di coltura completo (incluso il 5% di FBS) utilizzato per sospendere le cellule isolate dai frammenti di corallo.La vitalità delle cellule coralline è ridotta in assenza di siero4, ma un approccio alternativo potrebbe utilizzare un terreno di coltura completo realizzato con siero inattivato dal calore26.Poiché entrambi questi test si basano sulla normalizzazione delle misurazioni a un riferimento per quantificare la vitalità cellulare, non abbiamo perseguito un'ulteriore ottimizzazione dei test in questo studio.Una delle complicazioni associate alla ricerca sui coralli in vitro è l'adesione cellulare limitata.Rispetto alle linee cellulari di mammifero aderenti che si attaccano al substrato, le cellule di corallo hanno mostrato un attaccamento limitato alle fiasche e alle piastre di coltura standard4.Qui abbiamo lavorato con celle miste e non ordinate;pertanto, abbiamo aumentato l'attaccamento cellulare rivestendo le piastre dei pozzetti con poli-d-lisina per ridurre la perdita cellulare durante l'aspirazione.Senza poli-d-lisina, la conta cellulare è diminuita drasticamente e ha raggiunto livelli inferiori alla massa critica.La poli-d-lisina ha avuto l'effetto collaterale di intrappolare le nanoparticelle di TiO2 che hanno provocato la persistenza degli agglomerati di TiO2 dopo il lavaggio del mezzo di esposizione, che è visibilmente presente nelle immagini in campo chiaro.L'intrappolamento delle particelle di TiO2 potrebbe aver ridotto le loro interazioni con le cellule di P. damicornis e influenzato la citotossicità misurata.Le nanoparticelle di TiO2 hanno forti proprietà fotoattive UV che hanno portato al loro maggiore utilizzo in vernici, celle solari e filtri solari e di conseguenza al loro rilascio involontario nell'ambiente27.La tossicità dell'esposizione alle particelle di TiO2 in vari organismi d'acqua dolce (esaminati in 28) e marini (esaminati in 29) è stata testata ed è stato dimostrato che la tossicità aumenta con l'esposizione ai raggi UV dovuta alla fotoattivazione 28,29.È importante notare che le condizioni UV non sono sempre segnalate, rendendo difficile determinare la citotossicità potenziata dai raggi UV.I requisiti di luce dei coralli che costruiscono la barriera comportano intrinsecamente l'esposizione ai raggi UV e abbiamo applicato un ciclo di 10 ore di luce/14 ore di buio (PAR 40 ± 2, ovvero ~ 8,71 W/m2 = 0,0871 mJ/cm2, vedere la sezione "Materiali e metodi" per maggiori dettagli) durante tutta la nostra sperimentazione.È stato dimostrato che le particelle di TiO2, con dimensioni delle particelle comprese tra 20 e 200 nm, danneggiano i dinoflagellati simbiotici e inducono lo sbiancamento in Acropora spp.coralli30 e Montastraea faveolata31.Sia in Acropora che in Montastraea, si è verificato un leggero sbiancamento dopo l'esposizione a 6,3 mg/L di TiO2 per un massimo di 48 ore ea 10 mg/L di TiO2 per 17 giorni.I nostri risultati confermano questi risultati con una riduzione della vitalità cellulare a partire da 10 mg/L TiO2 con LC50 a 6,21 mg/L con un'intensità UV cinque volte inferiore a quella riscontrata nell'ambiente.Le concentrazioni di TiO2 misurate nell'acqua di mare raccolta nelle zone costiere sono risultate comprese tra 0,02 e 0,9 mg/L di TiO2 al giorno sulla base di uno studio condotto lungo tre spiagge nel sud della Francia32 e tra 7 e 40 µg/mL di TiO2 lungo tre spiagge dell'isola di Maiorca33 Queste concentrazioni, che sono state correlate all'uso di creme solari da parte dei bagnanti, sono ordini di grandezza inferiori alla CL50 trovata qui;tuttavia, gli studi fino ad oggi, compreso il nostro, rappresentano solo esposizioni a breve termine.Il mutualismo simbiotico tra l'ospite corallo e gli endosimbionti dinoflagellati soddisfa fino al 90% dei bisogni energetici dell'olobionte.Questo traffico di energia suggerisce un sistema di trasporto e segnalazione in cui potrebbe entrare in gioco una molecola come l'insulina.Inoltre, poiché lo sbiancamento comporta la rottura della simbiosi, questo sistema di trasporto e segnalazione può essere interrotto, presumibilmente con somiglianze con la risposta diabetica nei vertebrati.La produzione di insulina è riconosciuta come un'antica funzione evolutiva e la sua presenza è stata dimostrata in molti organismi oltre che nell'uomo (eucarioti unicellulari, funghi, vermi, moscerini della frutta).Esistono numerose segnalazioni di pseudogeni simili alla preproinsulina in una varietà di organismi diversi tra cui insetti, invertebrati, piante ed eucarioti e procarioti microbici34.Sorprendentemente, l'insulina umana ha dimostrato di avere effetti fisiologici su altri organismi, come Acanthamoeba castellanii35, suggerendo una conservazione della struttura e della funzione attraverso lunghe distanze evolutive.Una scansione computazionale dell'intero genoma di P. damicornis ha predetto sequenze proteiche, utilizzando Hhblits36 per cercare omologhi remoti di sequenze proteiche umane, prevede che le cellule di P. damicornis (corallo ospite) abbiano recettori per l'insulina e l'insulina (vedi Materiale supplementare S.3)37 .Per consentire future indagini su questa ipotesi, abbiamo studiato qui la citotossicità dell'insulina come esempio di proteotossicità.L'insulina è stata un sistema modello per lo studio della proteotossicità nell'evoluzione delle proteine38 e diverse conformazioni e stati di oligomerizzazione dell'insulina sono rilevanti nell'eziologia e nel trattamento del diabete39,40.Pertanto, il primo passo naturale nella valutazione degli effetti dell'insulina su P. damicornis è la sua potenziale citotossicità.I nostri risultati suggeriscono che l'insulina riduce la vitalità cellulare di P. damicornis (~ 18% di diminuzione) a concentrazioni comprese tra 10 e 100 µg/mL.È noto che la citotossicità dell'insulina dipende da diverse proprietà del solvente, come l'aumento della temperatura e le alte concentrazioni di sali41,42, che portano ad aggregati di insulina e misfolding.La salinità o la forza ionica dell'acqua di mare potrebbero aver avuto effetti simili nonostante la temperatura relativamente bassa (25 °C) e la natura basica del mezzo di coltura.Pertanto, è possibile che l'acqua di mare possa modificare la conformazione dell'insulina e il comportamento citotossico, e il presente lavoro pone le basi per ulteriori ricerche relative agli effetti dell'insulina sui coralli.La concentrazione di insulina nel siero utilizzato purtroppo non era disponibile, tuttavia, sulla base di prodotti simili, stimiamo che l'insulina dell'FBS utilizzato abbia contribuito per meno dello 0,04% alla concentrazione più bassa testata (0,5 µg/mL) per la citotossicità in questo studio.Indipendentemente dall'organismo studiato, il tipo di meccanismo di morte cellulare dipende fortemente dalla natura e dalla durata dello stress applicato e dalla capacità delle cellule di mantenere l'omeostasi.Il controllo positivo, Triton X-100, è un tensioattivo comune utilizzato per la lisi delle cellule.È citotossico per diversi tipi di cellule: protozoi ciliati, pesci e mammiferi43.Usarlo come controllo positivo per i test di integrità della membrana comporta la comprensione che il conteggio delle cellule diminuirà con l'aumento della concentrazione di Triton X-100.Diversi meccanismi di morte cellulare possono essere coinvolti quando le cellule di corallo sono esposte a sostanze come l'insulina e le NP di TiO2 testate qui.Pertanto, il Triton X-100 funge da controllo positivo per verificare che il test abbia funzionato e sono necessarie ulteriori ricerche per identificare i meccanismi della morte cellulare.Ad esempio, nelle cellule di mammifero, l'assenza di attivazione della caspasi, il rilascio del citocromo c, la frammentazione del DNA, il danno alla membrana e i cambiamenti nella morfologia cellulare sono tutti parametri cellulari che possono essere utilizzati per discriminare la necrosi cellulare dall'apoptosi44 e altri tipi di morte cellulare.Questa distinzione è particolarmente rilevante anche nello studio della disbiosi.La rottura della simbiosi tra alghe dinoflagellate endosimbiotiche e corallo ospite non è ancora ben compresa45 nonostante l'urgente necessità di caratterizzare lo sbiancamento dei coralli a livello cellulare.Le colture stabili delle cellule gastrodermiche che detengono l'endosimbionte, combinate con i test di citotossicità e meccanismo di morte cellulare, potrebbero aiutare a definire meglio i meccanismi della disbiosi dei coralli-dinoflagellati.La perdita globale della copertura corallina causata dal cambiamento climatico antropogenico ha sottolineato la necessità di una migliore comprensione della biologia cellulare dei coralli.I progressi della ricerca in questo settore saranno guidati dall'ottimizzazione dei metodi di coltura di cellule di invertebrati marini e dal potenziale trasferimento di metodi in vitro sviluppati per organismi modello.La vitalità cellulare è una misura chiave e lo sviluppo di test di integrità della membrana per la coltura di cellule di corallo rappresenta un passo essenziale nel progresso della ricerca in vitro sui coralli.I nostri risultati mostrano che la coppia di coloranti Hoechst-SYTOX è adatta per le valutazioni dell'integrità della membrana nelle cellule di P. damicornis.Questa coppia di coloranti è stata utilizzata per misurare quantitativamente la tossicità di Triton X-100, TiO2 e insulina nelle cellule di corallo per la prima volta in vitro.Questi risultati aprono la porta a una valutazione quantitativa approfondita della tossicità di diversi reagenti sui coralli a livello cellulare.Inoltre, l'ulteriore sviluppo di analisi cellulari fornirà nuovi strumenti per comprendere meglio la fisiologia cellulare degli cnidari, gli scambi transmembrana ei meccanismi di morte cellulare.Frammenti di Pocillopora damicornis (ORA Aquaculture acquistati da Live Aquaria, FL) sono stati mantenuti in acquari da 37,8 litri e forniti con acqua di mare artificiale ossigenata (ASW, gorgogliamento costante, acqua deionizzata ad osmosi inversa [5 Stage Premium RO/DI water saver system from Bulk Reef Supply ] + sali Fritz Reef Pro Mix, SG 1,025 ± 0,002, pH 7,5–8, 25 °C ± 1 °C, portata pompa: 378,5 L/H, filtro pompa: carbone attivo Aqueon, 10 h-light/14 h- dark cycle AI Prime 16HD Reef light: blu 28%, royal 28%, green 28%, deep red 28%, UV 28%, violet 28%, cool white 28%, moonlight 28%, PAR 40 ± 2).Lo spettro della luce AI Prime 16HD varia da 380 a 700 nm con la massima lunghezza d'onda di picco di intensità pari a 450 nm al picco PAR di 100 Mol (https://www.aquaillumination.com/products/prime).Le lunghezze d'onda dei LED sono le seguenti: blu 460–490 nm, blu reale 450 nm, verde 520–550 nm, rosso intenso 660 nm, UV 400 nm, viola 415 nm (nota: nessuna lunghezza d'onda disponibile per i LED al chiaro di luna).La manutenzione settimanale generale includeva la pulizia della vasca per rimuovere la crescita eccessiva di macroalghe, l'alimentazione dei coralli (artemie vive: uova di artemia salina della Carolina) e la sostituzione di 2 litri di acqua di mare.Il protocollo di dissociazione cellulare segue quello riportato in Roger et al.4 In breve, un nubbin di corallo (P. damicornis) di ~ 5 mm di lunghezza è stato tagliato usando clipper sterili e posto in acqua di mare artificiale (RO/DI H2O + Fritz Reef Pro Mix) con Disinfettante per coralli Reef Dip (25 µL/mL di acqua di mare) sotto costante gorgogliamento per 10 min.Il nubbin è stato quindi risciacquato con filtro sterile (membrana in polietersulfone con pori da 0,22 µm per rimuovere eventuali particolati), ASW autoclavato 3 volte e incubato in ASW privo di calcio e magnesio (autoclavato e filtrato sterile) per 1 ora in un armadio di biosicurezza a temperatura ambiente leggero.Il nocciolo è stato quindi lavato utilizzando la soluzione nella fiala per staccare le cellule rimanenti e massimizzare il conteggio delle cellule.La sospensione cellulare è stata centrifugata a 1200 rpm (204 RCF) per 3 minuti a 25 °C e il supernatante sostituito con terreno di coltura completo (CM).Il CM completo è composto da 15% Dulbecco's Modified Eagle Medium (senza rosso fenolo, con 17.491 M d -glucosio, 2.50 mM l -glutammina) + 5% siero fetale bovino + 0.5% antibiotico-antimicotico + 0.5% gentamicina + 79% filtrato ASW sterile.Le cellule di corallo dissociate nel CM di corallo completo sono state placcate in piastre da 96 pozzetti rivestite di poli-d-lisina a una densità di ~ 400.000 cellule per pozzetto.Le piastre da 96 pozzetti rivestite con poli-d-lisina (ThermoFisher cat. N. A3890401) sono state preparate seguendo il protocollo del produttore.La vitalità iniziale è stata valutata utilizzando un'aliquota di 1 mL della sospensione cellulare colorata con la soluzione di colorazione viva/morta Hoechst 33342/SYTOX Orange e contata su un emocitometro monouso (INCYTO C-Chip, formato Neubauer Improved) prima della placcatura.Dopo un periodo di riposo di 1 ora (per consentire la potenziale riparazione della membrana46 e l'attaccamento al substrato di coltura rivestito di polilisina47), le cellule sono state incubate solo in CM di corallo (controllo negativo) o CM di corallo contenente diluizioni seriali (0,5, 1, 5, 10, 50 e 100 µg/mL) of Triton X-100 (positive control, Sigma-Aldrich cat. no. T8787), insulin (human recombinant (yeast), MilliporeSigma cat. no. 11376497001), or TiO2 nanoparticles (nanopowder, 21 nm primary particle size, ≥ 99.5% trace metals basis, Sigma-Aldrich cat. no. 718467, characterization data presented in Supplementary Materials S.4) for 24 h at 25 °C.Sci.Sci.soc.Proc.Sci.Sci.Sci.Int.Sci.Sci.Sci.Sci.Articolo ADS CAS Google ScholarArticolo ADS CAS Google ScholarSci.Puoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarPuoi anche cercare questo autore in PubMed Google ScholarGli autori non dichiarano interessi concorrenti.Springer Nature rimane neutrale per quanto riguarda le rivendicazioni giurisdizionali nelle mappe pubblicate e le affiliazioni istituzionali.Accesso aperto Questo articolo è concesso in licenza con una licenza internazionale Creative Commons Attribution 4.0, che consente l'uso, la condivisione, l'adattamento, la distribuzione e la riproduzione in qualsiasi mezzo o formato, a condizione che tu dia il merito appropriato all'autore o agli autori originali e alla fonte, fornire un collegamento alla licenza Creative Commons e indicare se sono state apportate modifiche.Le immagini o altro materiale di terze parti in questo articolo sono inclusi nella licenza Creative Commons dell'articolo, se non diversamente indicato in una linea di credito al materiale.Se il materiale non è incluso nella licenza Creative Commons dell'articolo e l'uso previsto non è consentito dalla normativa legale o eccede l'uso consentito, sarà necessario ottenere l'autorizzazione direttamente dal detentore del copyright.Per visualizzare una copia di questa licenza, visitare http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Chiunque con cui condividi il seguente link sarà in grado di leggere questo contenuto:Siamo spiacenti, un link condivisibile non è attualmente disponibile per questo articolo.Fornito dall'iniziativa di condivisione dei contenuti Springer Nature SharedItInviando un commento accetti di rispettare i nostri Termini e le Linee guida della community.Se trovi qualcosa di offensivo o che non è conforme ai nostri termini o linee guida, segnalalo come inappropriato.Rapporti scientifici (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (online)Iscriviti alla newsletter Nature Briefing: ciò che conta nella scienza, gratuitamente nella tua casella di posta ogni giorno.